Разница между NGS и секвенированием по Сэнгеру

2024 Автор: Mildred Bawerman | [email protected]. Последнее изменение: 2023-12-16 08:42

Ключевое отличие - NGS против секвенирования по Сэнгеру

Секвенирование следующего поколения (NGS) и секвенирование по Сэнгеру - это два типа методов нуклеотидного секвенирования, разработанные с течением времени. Метод секвенирования по Сэнгеру широко использовался в течение многих лет, и недавно он пришел на смену NGS благодаря своим преимуществам. Ключевое различие между NGS и секвенированием по Сэнгеру заключается в том, что NGS работает по принципу одновременного быстрого секвенирования миллионов последовательностей с помощью системы секвенирования, в то время как секвенирование по Сэнгеру работает по принципу терминации цепи за счет избирательного включения дидезоксинуклеотидов ферментом ДНК-полимеразой. во время репликации ДНК и последующего разделения фрагментов капиллярным электрофорезом.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Обзор и основные различия

2. Что такое нуклеотидное секвенирование

3. Что такое NGS

4. Что такое секвенирование по Сэнгеру

5. Сравнение бок о бок - NGS и секвенирование по Сэнгеру

6. Резюме

Что такое нуклеотидное секвенирование?

Генетическая информация хранится в нуклеотидных последовательностях ДНК или РНК организма. Процесс определения правильного порядка нуклеотидов (с использованием четырех оснований) в данном фрагменте (в гене, кластере генов, хромосоме и полном геноме) известен как секвенирование нуклеотидов. Анализ структуры и функций генов очень важен в геномных исследованиях, судебно-медицинских исследованиях, вирусологии, биологической систематике, медицинской диагностике, биотехнологии и во многих других областях. Ученые разработали различные методы секвенирования. Среди них секвенирование по Сэнгеру, разработанное Фредериком Сэнгером в 1977 году, широко использовалось и популяризировалось в течение длительного периода времени, пока его не заменило секвенирование следующего поколения.

Что такое NGS?

Секвенирование следующего поколения (NGS) - это термин, используемый для обозначения современных процессов секвенирования с высокой пропускной способностью. В нем описывается ряд различных современных технологий секвенирования, которые произвели революцию в геномных исследованиях и молекулярной биологии. Этими методами являются секвенирование Illumina, секвенирование Roche 454, секвенирование ионных протонов и секвенирование SOLiD (секвенирование с помощью обнаружения лигирования олигонуклеотидов). Системы NGS быстрее и дешевле. В системах NGS используются четыре основных метода секвенирования ДНК: пиросеквенирование, секвенирование путем синтеза, секвенирование путем лигирования и секвенирование ионных полупроводников. Параллельно можно секвенировать большое количество нитей ДНК или РНК (миллионы). Это позволяет секвенировать весь геном организмов за короткий период времени, в отличие от секвенирования по Сэнгеру, которое занимает больше времени.

NGS имеет много преимуществ перед традиционным методом секвенирования по Сэнгеру. Это высокоскоростной, более точный и экономичный процесс, который может быть выполнен с небольшим размером выборки. NGS можно использовать в метагеномных исследованиях, при обнаружении вариаций в пределах отдельного генома из-за вставок, делеций и т. Д., А также при анализе экспрессии генов.

Рисунок_1: Развитие секвенирования NGS

Что такое секвенирование по Сэнгеру?

Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году для определения точного порядка нуклеотидов в данном фрагменте ДНК. Это также известно как секвенирование обрыва цепи или дидезокси-секвенирование. Принцип работы этого метода заключается в прекращении синтеза цепи путем избирательного включения дидезоксинуклеотидов, завершающих цепь (ddNTP), таких как ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP, с помощью ДНК-полимеразы во время репликации ДНК. Нормальные нуклеотиды имеют 3 'OH-группы для образования фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами для продолжения образования цепи. Однако в ddNTP отсутствует эта 3 'OH-группа и они не могут образовывать фосфодиэфирные связи между нуклеотидами. Следовательно, удлинение цепи прекращается.

В этом методе одноцепочечная ДНК, подлежащая секвенированию, служит в качестве цепи-матрицы для синтеза ДНК in vitro. Другими требованиями являются олигонуклеотидный праймер, предшественники дезоксинуклеотидов и фермент ДНК-полимераза. Когда фланкирующие концы целевого фрагмента известны, можно легко сконструировать праймеры для репликации ДНК. Четыре отдельные реакции синтеза ДНК выполняются в четырех отдельных пробирках. Каждая пробирка имеет отдельные ddNTP, а также другие требования. Из конкретного нуклеотида добавляется смесь dNTP и ddNTP. Подобным образом четыре отдельных реакции проводят в четырех пробирках с четырьмя смесями. После реакций выполняется обнаружение фрагментов ДНК и преобразование структуры фрагментов в информацию о последовательности. Полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют с помощью гель-электрофореза. Если используются радиоактивные нуклеотиды, полосу в полиакриламидном геле можно визуализировать с помощью авторадиографии. Когда в этом методе используются флуоресцентно меченые дидезоксинуклеотиды, его можно уменьшить при считывании геля и пропустить через луч лазера для обнаружения флуоресцентным детектором. Чтобы избежать ошибок, которые могут возникнуть, когда последовательность считывается глазом и вводится вручную в компьютер, этот метод превратился в использование автоматического секвенсора, соединенного с компьютером. Чтобы избежать ошибок, которые могут возникнуть, когда последовательность считывается глазом и вводится вручную в компьютер, этот метод превратился в использование автоматического секвенсора, соединенного с компьютером. Чтобы избежать ошибок, которые могут возникнуть, когда последовательность считывается глазом и вводится вручную в компьютер, этот метод превратился в использование автоматического секвенсора, соединенного с компьютером.

Это метод, используемый для секвенирования ДНК из проекта «Геном человека». Этот метод все еще используется с расширенными модификациями, потому что он дает точную информацию о последовательности, несмотря на то, что это дорогой и медленный процесс.

Рисунок_2: Секвенирование по Сэнгеру

В чем разница между NGS и секвенированием по Сэнгеру?

Различать статью в середине перед таблицей

NGS против секвенирования по Сэнгеру
Секвенирование следующего поколения (NGS) относится к современным процессам секвенирования с высокой пропускной способностью. В нем описывается ряд различных современных технологий секвенирования.	Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером для определения точного порядка нуклеотидов в данном фрагменте ДНК.
Рентабельность
NGS - более дешевый процесс, поскольку он сокращает время, человеческие ресурсы и химикаты.	Это дорогостоящий процесс, потому что он требует времени, человеческих ресурсов и большего количества химикатов.
Скорость
Это быстрее, так как химическое обнаружение и обнаружение сигналов многих нитей происходит параллельно.	Это отнимает много времени, поскольку химическое обнаружение и обнаружение сигнала происходит как два отдельных процесса, и только на нити можно считывать одновременно.
Надежность
NGS надежен.	Секвенирование по Сэнгеру менее надежно
Размер образца
NGS требует меньшего количества ДНК.	Для этого метода требуется большое количество матричной ДНК.
Оснований ДНК на секвенированный фрагмент
Количество оснований ДНК на секвенированный фрагмент меньше, чем у метода Сэнгера.	Генерирующие последовательности длиннее, чем последовательности NGS.

Резюме - NGS против секвенирования по Сэнгеру

NGS и секвенирование по Сэнгеру - это методы секвенирования нуклеотидов, широко используемые в молекулярной биологии. Секвенирование по Сэнгеру - это ранний метод секвенирования, который был заменен NGS. Основное различие между NGS и секвенированием по Сэнгеру заключается в том, что NGS - это высокоскоростной, более точный и экономичный процесс, чем секвенирование по Сэнгеру. Оба метода вызвали серьезные вспышки в генетике и биотехнологии.