Ключевое отличие - NGS против секвенирования по Сэнгеру
Секвенирование следующего поколения (NGS) и секвенирование по Сэнгеру - это два типа методов нуклеотидного секвенирования, разработанные с течением времени. Метод секвенирования по Сэнгеру широко использовался в течение многих лет, и недавно он пришел на смену NGS благодаря своим преимуществам. Ключевое различие между NGS и секвенированием по Сэнгеру заключается в том, что NGS работает по принципу одновременного быстрого секвенирования миллионов последовательностей с помощью системы секвенирования, в то время как секвенирование по Сэнгеру работает по принципу терминации цепи за счет избирательного включения дидезоксинуклеотидов ферментом ДНК-полимеразой. во время репликации ДНК и последующего разделения фрагментов капиллярным электрофорезом.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Обзор и основные различия
2. Что такое нуклеотидное секвенирование
3. Что такое NGS
4. Что такое секвенирование по Сэнгеру
5. Сравнение бок о бок - NGS и секвенирование по Сэнгеру
6. Резюме
Что такое нуклеотидное секвенирование?
Генетическая информация хранится в нуклеотидных последовательностях ДНК или РНК организма. Процесс определения правильного порядка нуклеотидов (с использованием четырех оснований) в данном фрагменте (в гене, кластере генов, хромосоме и полном геноме) известен как секвенирование нуклеотидов. Анализ структуры и функций генов очень важен в геномных исследованиях, судебно-медицинских исследованиях, вирусологии, биологической систематике, медицинской диагностике, биотехнологии и во многих других областях. Ученые разработали различные методы секвенирования. Среди них секвенирование по Сэнгеру, разработанное Фредериком Сэнгером в 1977 году, широко использовалось и популяризировалось в течение длительного периода времени, пока его не заменило секвенирование следующего поколения.
Что такое NGS?
Секвенирование следующего поколения (NGS) - это термин, используемый для обозначения современных процессов секвенирования с высокой пропускной способностью. В нем описывается ряд различных современных технологий секвенирования, которые произвели революцию в геномных исследованиях и молекулярной биологии. Этими методами являются секвенирование Illumina, секвенирование Roche 454, секвенирование ионных протонов и секвенирование SOLiD (секвенирование с помощью обнаружения лигирования олигонуклеотидов). Системы NGS быстрее и дешевле. В системах NGS используются четыре основных метода секвенирования ДНК: пиросеквенирование, секвенирование путем синтеза, секвенирование путем лигирования и секвенирование ионных полупроводников. Параллельно можно секвенировать большое количество нитей ДНК или РНК (миллионы). Это позволяет секвенировать весь геном организмов за короткий период времени, в отличие от секвенирования по Сэнгеру, которое занимает больше времени.
NGS имеет много преимуществ перед традиционным методом секвенирования по Сэнгеру. Это высокоскоростной, более точный и экономичный процесс, который может быть выполнен с небольшим размером выборки. NGS можно использовать в метагеномных исследованиях, при обнаружении вариаций в пределах отдельного генома из-за вставок, делеций и т. Д., А также при анализе экспрессии генов.
Рисунок_1: Развитие секвенирования NGS
Что такое секвенирование по Сэнгеру?
Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году для определения точного порядка нуклеотидов в данном фрагменте ДНК. Это также известно как секвенирование обрыва цепи или дидезокси-секвенирование. Принцип работы этого метода заключается в прекращении синтеза цепи путем избирательного включения дидезоксинуклеотидов, завершающих цепь (ddNTP), таких как ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP, с помощью ДНК-полимеразы во время репликации ДНК. Нормальные нуклеотиды имеют 3 'OH-группы для образования фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами для продолжения образования цепи. Однако в ddNTP отсутствует эта 3 'OH-группа и они не могут образовывать фосфодиэфирные связи между нуклеотидами. Следовательно, удлинение цепи прекращается.
В этом методе одноцепочечная ДНК, подлежащая секвенированию, служит в качестве цепи-матрицы для синтеза ДНК in vitro. Другими требованиями являются олигонуклеотидный праймер, предшественники дезоксинуклеотидов и фермент ДНК-полимераза. Когда фланкирующие концы целевого фрагмента известны, можно легко сконструировать праймеры для репликации ДНК. Четыре отдельные реакции синтеза ДНК выполняются в четырех отдельных пробирках. Каждая пробирка имеет отдельные ddNTP, а также другие требования. Из конкретного нуклеотида добавляется смесь dNTP и ddNTP. Подобным образом четыре отдельных реакции проводят в четырех пробирках с четырьмя смесями. После реакций выполняется обнаружение фрагментов ДНК и преобразование структуры фрагментов в информацию о последовательности. Полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют с помощью гель-электрофореза. Если используются радиоактивные нуклеотиды, полосу в полиакриламидном геле можно визуализировать с помощью авторадиографии. Когда в этом методе используются флуоресцентно меченые дидезоксинуклеотиды, его можно уменьшить при считывании геля и пропустить через луч лазера для обнаружения флуоресцентным детектором. Чтобы избежать ошибок, которые могут возникнуть, когда последовательность считывается глазом и вводится вручную в компьютер, этот метод превратился в использование автоматического секвенсора, соединенного с компьютером. Чтобы избежать ошибок, которые могут возникнуть, когда последовательность считывается глазом и вводится вручную в компьютер, этот метод превратился в использование автоматического секвенсора, соединенного с компьютером. Чтобы избежать ошибок, которые могут возникнуть, когда последовательность считывается глазом и вводится вручную в компьютер, этот метод превратился в использование автоматического секвенсора, соединенного с компьютером.
Это метод, используемый для секвенирования ДНК из проекта «Геном человека». Этот метод все еще используется с расширенными модификациями, потому что он дает точную информацию о последовательности, несмотря на то, что это дорогой и медленный процесс.
Рисунок_2: Секвенирование по Сэнгеру
В чем разница между NGS и секвенированием по Сэнгеру?
Различать статью в середине перед таблицей
NGS против секвенирования по Сэнгеру |
|
| Секвенирование следующего поколения (NGS) относится к современным процессам секвенирования с высокой пропускной способностью. В нем описывается ряд различных современных технологий секвенирования. | Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером для определения точного порядка нуклеотидов в данном фрагменте ДНК. |
| Рентабельность | |
| NGS - более дешевый процесс, поскольку он сокращает время, человеческие ресурсы и химикаты. | Это дорогостоящий процесс, потому что он требует времени, человеческих ресурсов и большего количества химикатов. |
| Скорость | |
| Это быстрее, так как химическое обнаружение и обнаружение сигналов многих нитей происходит параллельно. | Это отнимает много времени, поскольку химическое обнаружение и обнаружение сигнала происходит как два отдельных процесса, и только на нити можно считывать одновременно. |
| Надежность | |
| NGS надежен. | Секвенирование по Сэнгеру менее надежно |
| Размер образца | |
| NGS требует меньшего количества ДНК. | Для этого метода требуется большое количество матричной ДНК. |
| Оснований ДНК на секвенированный фрагмент | |
| Количество оснований ДНК на секвенированный фрагмент меньше, чем у метода Сэнгера. | Генерирующие последовательности длиннее, чем последовательности NGS. |
Резюме - NGS против секвенирования по Сэнгеру
NGS и секвенирование по Сэнгеру - это методы секвенирования нуклеотидов, широко используемые в молекулярной биологии. Секвенирование по Сэнгеру - это ранний метод секвенирования, который был заменен NGS. Основное различие между NGS и секвенированием по Сэнгеру заключается в том, что NGS - это высокоскоростной, более точный и экономичный процесс, чем секвенирование по Сэнгеру. Оба метода вызвали серьезные вспышки в генетике и биотехнологии.
