Ключевое различие - секвенирование по Сэнгеру против пиросеквенирования
Секвенирование ДНК очень важно для анализа ДНК, поскольку знание правильного расположения нуклеотидов в определенной области ДНК дает много важной информации о ней. Существуют разные методы секвенирования ДНК. Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование - это два разных метода секвенирования ДНК, широко используемых в молекулярной биологии. Ключевое различие между секвенированием по Сэнгеру и пиросеквенированием заключается в том, что в секвенировании по Сэнгеру используются дидезоксинуклеотиды для прекращения синтеза ДНК для считывания нуклеотидной последовательности, в то время как пиросеквенирование обнаруживает высвобождение пирофосфата путем включения нуклеотидов и синтеза комплементарной последовательности для чтения точного порядка последовательности.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Обзор и основные различия
2. Что такое секвенирование по Сэнгеру
3. Что такое пиросеквенирование
4. Сравнение бок о бок - секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование
5. Резюме
Что такое секвенирование по Сэнгеру?
Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования ДНК первого поколения, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году. Он также известен как секвенирование с окончанием цепи или дидезокси-секвенирование, поскольку оно основано на терминации цепи дидезоксинуклеотидами (ddNTP). Этот метод широко использовался более 30 лет, пока не было разработано секвенирование нового поколения (NGS). Метод секвенирования по Сэнгеру позволил обнаружить правильный порядок нуклеотидов или присоединение определенного фрагмента ДНК. Он основан на избирательном включении ddNTP и прекращении синтеза ДНК во время репликации ДНК in vitro. Отсутствие 3 'OH-групп для продолжения образования фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами является уникальной особенностью ddNTP. Следовательно, как только ddNTP присоединяется, удлинение цепи прекращается и заканчивается в этой точке. В секвенировании по Сэнгеру используются четыре ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP и ddTTP. Эти нуклеотиды останавливают процесс репликации ДНК, когда они включаются в растущую цепь ДНК, и в результате образуются короткие ДНК различной длины. Капиллярный гель-электрофорез используется для организации этих коротких цепей ДНК по их размеру на геле, как показано на рисунке 01.
Рисунок 1: Капиллярный гель-электрофорез синтезированной короткой ДНК
Для репликации ДНК in vitro необходимо предъявить несколько требований. Это фермент ДНК-полимераза, матричная ДНК, олигонуклеотидные праймеры и дезоксинуклеотиды (dNTP). При секвенировании по Сэнгеру репликация ДНК выполняется в четырех отдельных пробирках вместе с четырьмя типами ddNTP отдельно. Дезоксинуклеотиды полностью не заменяются соответствующими ддНТФ. Смесь конкретных dNTP (например, dATP + ddATP) включается в пробирку и реплицируется. Четыре отдельных пробирки продукта вводят в гель в четырех отдельных лунках. Затем, считывая гель, последовательность может быть построена, как показано на рисунке 02.
Рисунок 02: Секвенирование по Сэнгеру
Секвенирование по Сэнгеру - важный метод, помогающий во многих областях молекулярной биологии. Проект генома человека был успешно завершен с помощью методов секвенирования по Сэнгеру. Секвенирование по Сэнгеру также полезно для секвенирования целевой ДНК, исследований рака и генетических заболеваний, анализа экспрессии генов, идентификации человека, обнаружения патогенов, микробного секвенирования и т. Д.
Есть несколько недостатков секвенирования по Сэнгеру:
- Длина секвенируемой ДНК не может превышать 1000 пар оснований.
- За один раз можно секвенировать только одну нить.
- Процесс трудоемкий и дорогостоящий.
Поэтому со временем были разработаны новые передовые методы секвенирования, чтобы преодолеть эти проблемы. Тем не менее, секвенирование по Сэнгеру все еще используется из-за его высокоточных результатов для фрагментов длиной примерно до 850 пар оснований.
Что такое пиросеквенирование?
Пиросеквенирование - это новый метод секвенирования ДНК, основанный на «секвенировании путем синтеза». Этот метод основан на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотида. В этом процессе задействованы четыре различных фермента: ДНК-полимера, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза, а также два субстрата - аденозин-5'-фосфосульфат (APS) и люциферин.
Процесс начинается со связывания праймера с одноцепочечной ДНК-матрицей, а ДНК-полимераза запускает включение комплементарных ей нуклеотидов. Когда нуклеотиды соединяются вместе (полимеризация нуклеиновой кислоты), он высвобождает пирофосфатные (две связанные вместе фосфатные группы) группы и энергию. Каждое добавление нуклеотида высвобождает эквимолярное количество пирофосфата. Пирофосфат превращается в АТФ с помощью АТФ-сульфурилазы в присутствии субстрата АФС. Генерируемый АТФ запускает опосредованное люциферазой превращение люциферина в оксилюциферин, производя видимый свет в количествах, пропорциональных количеству АТФ. Свет обнаруживается устройством обнаружения фотонов или фотоумножителем и создает пирограмму. Апираза разрушает АТФ и невключенные дНТФ в реакционную смесь. Добавление dNTP выполняется один раз. Поскольку добавление нуклеотидов известно по включению и обнаружению света, можно определить последовательность матрицы. Пирограмма используется для создания нуклеотидной последовательности образца ДНК, как показано на рисунке 03.
Пиросеквенирование очень важно при анализе однонуклеотидного полиморфизма и секвенировании коротких участков ДНК. Высокая точность, гибкость, простота автоматизации и параллельная обработка - преимущества пиросеквенирования по сравнению с методами секвенирования по Сэнгеру.
Рисунок 03: Пиросеквенирование
В чем разница между секвенированием по Сэнгеру и пиросеквенированием?
Различать статью в середине перед таблицей
Секвенирование по Сэнгеру против пиросеквенирования |
|
| Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования ДНК, основанный на селективном включении ддНТФ с помощью ДНК-полимеразы и обрыва цепи. | Пиросеквенирование - это метод секвенирования ДНК, основанный на обнаружении высвобождения пирофосфата при включении нуклеотида. |
| Использование ddNTP | |
| ddNTP используются для прекращения репликации ДНК | ddNTP не используются. |
| Вовлеченные ферменты | |
| Используется ДНК-полимераза. | Используются четыре фермента: ДНК-полимераза, АТФ-сульфурилаза, люцифераза и апираза. |
| Используемые субстраты | |
| АПС и Люциферин не используются. | Используются аденозин-5'-фосфосульфат (APS) и люциферин. |
| Максимальная температура | |
| Это медленный процесс. | Это быстрый процесс. |
Резюме - Секвенирование по Сэнгеру против пиросеквенирования
Секвенирование по Сэнгеру и пиросеквенирование - это два метода секвенирования ДНК, используемые в молекулярной биологии. Секвенирование по Сэнгеру конструирует порядок нуклеотидов в последовательности путем прекращения удлинения цепи, в то время как пиросеквенирование конструирует точный порядок нуклеотидов в последовательности путем включения нуклеотидов и детектирования высвобождения пирофосфатов. Таким образом, основное различие между секвенированием по Сэнгеру и пиросеквенированием заключается в том, что секвенирование по Сэнгеру работает с секвенированием по обрыву цепи, а пиросеквенирование работает с секвенированием с помощью синтеза.
