Ключевое различие - северный против южного против вестерн-блоттинга
Обнаружение конкретных последовательностей ДНК, РНК и белков важно для различных типов исследований в области молекулярной биологии. Гель-электрофорез - это метод разделения ДНК, РНК и белков в соответствии с их размерами. Из профилей геля определенная последовательность ДНК, последовательность РНК или белок определяется с помощью специальных методов, называемых блоттингом и гибридизацией с мечеными зондами. Существует три различных метода блоттинга: южный, северный и западный. Ключевое различие между северным саузерн-блоттингом и вестерн-блоттингом заключается в типе молекулы, которую он обнаруживает в образце. Саузерн-блоттинг - это метод обнаружения определенной последовательности ДНК в образце ДНК. Нозерн-блоттинг - это метод, который определяет конкретную последовательность РНК из образца РНК. Вестерн-блоттинг - это метод обнаружения определенного белка в образце белка.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Обзор и основные отличия
2. Что такое Саузерн-блоттинг
3. Что такое Нозерн-блоттинг
4. Что такое Вестерн-блоттинг
5. Параллельное сравнение - Нозерн-блоттинг, Саузерн и Вестерн-блоттинг
6. Резюме
Что такое Саузерн-блоттинг?
Техника саузерн-блоттинга была разработана EM Southern в 1975 году для идентификации конкретной последовательности ДНК из образца ДНК. Это первый метод блоттинга, представленный в молекулярной биологии. Это позволило обнаружить определенные гены в ДНК, определенные фрагменты ДНК и т. Д. Техника саузерн-блоттинга включает несколько этапов. Они следующие.
- ДНК выделяется из образца и расщепляется эндонуклеазами рестрикции.
- Переваренный образец разделяют электрофорезом в агарозном геле.
- Фрагменты ДНК в геле денатурируют в отдельные цепи с помощью щелочного раствора.
- Одноцепочечная ДНК переносится на мембрану нитроцеллюлозного фильтра капиллярным переносом.
- Перенесенная ДНК постоянно фиксируется на мембране.
- Фиксированная ДНК на мембране гибридизируется с мечеными зондами.
- Несвязанная ДНК смывается с мембраны промыванием.
- Рентгеновскую пленку экспонируют на мембране и готовят авторадиограф.
Саузерн-блоттинг применяется для различных аспектов молекулярной биологии. Это полезно при картировании RFLP, судебно-медицинских исследованиях, метилировании ДНК при экспрессии генов, обнаружении мутировавших генов при генетических заболеваниях, снятии отпечатков пальцев ДНК и т. Д.
Рисунок 01: Техника саузерн-блоттинга
Что такое Нозерн-блоттинг?
Нозерн-блоттинг - это метод, разработанный для обнаружения определенной последовательности РНК или последовательности мРНК в образце с целью изучения экспрессии гена. Этот метод был разработан Альвином, Кемпом и Старком в 1979 году. Он отличается от методов кислого и вестерн-блоттинга несколькими этапами. Однако этот метод также выполняется с помощью гель-электрофореза, блоттинга и гибридизации со специфическими мечеными зондами и обнаружения. Техника нозерн-блоттинга выполняется следующим образом.
- РНК извлекается из образца и разделяется гель-электрофорезом.
- РНК переносится из геля на мембрану для блоттинга и фиксируется.
- Мембрану обрабатывают меченым зондом, полученным из кДНК или РНК (зонд комплементарен определенной последовательности в образце).
- Зонд инкубируется с мембраной для связывания с определенной последовательностью.
- Несвязанные зонды смываются.
- Гибридизованные фрагменты обнаруживают с помощью авторадиографа.
Нозерн-блоттинг - важный инструмент для обнаружения и количественной оценки гибридизированной мРНК, изучения деградации РНК, оценки периода полужизни РНК, обнаружения сплайсинга РНК, изучения экспрессии генов и т. Д.
Рисунок 02: Нозерн-блоттинг
Что такое вестерн-блоттинг?
Вестерн-блоттинг - это метод обнаружения определенного белка в смеси белков с использованием меченых антител. Поэтому вестерн-блоттинг также известен как иммуноблот. Этот метод был введен Towbin и др. В 1979 году, и теперь он регулярно применяется в лабораториях для анализа белков. Шаги следующие.
- Белки извлекаются из образца
- Белки разделяют по размеру с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
- Разделенные молекулы переносятся на мембрану из ПВДФ или нитроцеллюлозную мембрану путем электропорации.
- Мембрана заблокирована для неспецифического связывания с антителами.
- Перенесенные белки связываются с первичными антителами (антителами, меченными ферментами).
- Мембрану промывают для удаления неспецифически связанных первичных антител.
- Связанные антитела обнаруживают путем добавления субстрата и обнаружения образовавшегося окрашенного осадка.
Вестерн-блоттинг полезен при обнаружении антител против ВИЧ в образце сыворотки человека. Вестерн-блоттинг также можно использовать в качестве подтверждающего теста на инфекцию гепатита В и окончательного теста на коровье бешенство.
Рисунок 03: Вестерн-блоттинг
В чем разница между северным южным и вестерн-блоттингом?
Различать статью в середине перед таблицей
Северный против Южного против Вестерн-блоттинга |
|
| Тип обнаруженной молекулы | |
| Нозерн-блоттинг | Нозерн-блоттинг обнаруживает определенную последовательность РНК из образца РНК. |
| Саузерн-блоттинг | Саузерн-блоттинг обнаруживает конкретную последовательность ДНК из образца ДНК. |
| Вестерн-блоттинг | Вестерн-блоттинг определяет конкретный белок в образце белка. |
| Тип геля | |
| Нозерн-блоттинг | При этом используется гель агарозы / формальдегида. |
| Саузерн-блоттинг | Для этого используется гель агарозы. |
| Вестерн-блоттинг | Для этого используется полиакриламидный гель. |
| Метод блоттинга | |
| Нозерн-блоттинг | Это капиллярный перенос. |
| Саузерн-блоттинг | Это капиллярный перенос. |
| Вестерн-блоттинг | Это электрическая передача. |
| Используемые зонды | |
| Нозерн-блоттинг | кДНК или РНК-зонды, меченные радиоактивно или нерадиоактивно. |
| Саузерн-блоттинг | Зонды ДНК имеют радиоактивную или нерадиоактивную метку. |
| Вестерн-блоттинг | В качестве зондов используются первичные антитела. |
| Система обнаружения | |
| Нозерн-блоттинг | Это делается с помощью авторадиографа или обнаружения изменения света или цвета. |
| Саузерн-блоттинг | Это делается с помощью авторадиографа, обнаружения света или изменения цвета. |
| Вестерн-блоттинг | Это делается с помощью обнаружения света или изменения цвета. |
Заключение - Северный против Южного против Вестерн-блоттинга
Блоттинг - это специальный метод, разработанный для идентификации конкретных ДНК, РНК или белков в образцах. Существует три отдельных метода блоттинга, а именно северный, южный и западный, для обнаружения определенного типа молекулы. Метод Нозерн-блоттинга разработан для обнаружения конкретной последовательности РНК из смеси РНК. Метод саузерн-блоттинга позволяет обнаруживать конкретную последовательность ДНК в образце ДНК, а метод вестерн-блоттинга разработан для идентификации конкретного белка из смеси белков.
