Ключевое отличие - секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера
Нуклеотиды - это основные структурные единицы и строительные блоки ДНК. Молекула ДНК состоит из полинуклеотидной цепи. В ДНК обнаружены четыре разных нуклеотида. Эти нуклеотиды состоят из четырех различных азотистых оснований, названных A (аденин), G (гуанин), C (цитозин), T (тимин). Порядок нуклеотидов в молекуле ДНК имеет большое значение, поскольку он кодирует важную генетическую информацию для роста и развития организмов. Секвенирование ДНК относится к процессу определения точной нуклеотидной последовательности ДНК. Существуют разные методы секвенирования ДНК. Секвенирование Максама Гилберта и секвенирование ДНК Сэнгера - это два метода секвенирования ДНК, которые относятся к секвенированию первого поколения. Процедура секвенирования Maxam Gilbert определяет последовательность оснований путем химического расщепления меченных 5'-концом фрагментов ДНК, предпочтительно по каждому из четырех нуклеотидов, и гель-электрофореза. Процедура секвенирования по Сэнгеру определяет нуклеотидную последовательность путем синтеза одноцепочечной ДНК с использованием ДНК-полимеразы и дидезоксинуклеотидов и гель-электрофореза. Это ключевое различие между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера.
СОДЕРЖАНИЕ
1. Обзор и основные отличия
2. Что такое Максам Гилберт
3. Что такое секвенирование по Сэнгеру
4. Сравнение бок о бок - секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера
5. Резюме
Что такое секвенирование Максама Гилберта?
Секвенирование Максама Гилберта, также известное как метод химического секвенирования, - это метод, который был разработан для определения порядка нуклеотидов в ДНК. Этот метод был предложен Уолтером Гилбертом и Аланом Максамом в 1976 году и стал популярным, поскольку его можно выполнять непосредственно с очищенной ДНК. Метод Максама Гилберта принадлежит к первому поколению секвенирования ДНК, и это был первый метод секвенирования, широко используемый учеными.
Основной принцип этого метода заключается в ограничении концевых меченых фрагментов ДНК по определенным основаниям химическими веществами и условиями, специфичными для конкретных оснований, и разделением меченых фрагментов электрофорезом, как показано на рисунке 01. Фрагменты разделяются в соответствии с их размерами на гель. Поскольку фрагменты помечены, последовательность молекулы ДНК может быть легко выведена.
Метод Максама Гилберта использует химические вещества для разрыва ДНК по определенным основаниям. Два распространенных химиката, называемые диметилсульфатом и гидразином, используются для избирательной атаки пуринов и пиримидинов соответственно.
Метод секвенирования Maxam Gilbert выполняется в несколько этапов, как показано ниже.
- Очистка последовательности ДНК с использованием эндонуклеаз рестрикции
- Мечение концов фрагментов ДНК путем добавления радиоактивных фосфатов
- Очистка меченых фрагментов от немеченых фрагментов гель-электрофорезом
- Разделение ДНК с концевой меткой на четыре пробирки и отдельная обработка химическими веществами, специфичными для оснований.
- Электрофорез содержимого каждой пробирки на отдельных линиях на геле и разделение фрагментов по их длине.
- Обнаружение отломков с помощью авторадиографа.
Рисунок 01: Секвенирование Максама Гилберта
Что такое секвенирование по Сэнгеру?
Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году для определения базовой последовательности данного фрагмента ДНК. Он также известен как метод секвенирования обрыва цепи или метод дидезокси-секвенирования. Этот метод работает по принципу избирательного включения дидезоксинуклеотидов, завершающих цепь (ddNTP), таких как ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP, с помощью ДНК-полимеразы во время синтеза однонитевой ДНК для прекращения образования цепи. В дидезоксинуклеотидах отсутствуют 3 'ОН-группы для образования фосфодиэфирных связей с соседним нуклеотидом. Следовательно, образование цепи прекращается, как только ddNTP включается во вновь формирующуюся цепь во время секвенирования по Сэнгеру.
В этом методе четыре отдельных реакции синтеза ДНК (ПЦР) проводятся в четырех отдельных пробирках с одним типом ddNTP. К пробиркам для ПЦР также предъявляются другие требования, включая праймеры, dNTP, Taq-полимеразу, особые условия и т. Д. Четыре отдельных реакции проводят в четырех пробирках с четырьмя смесями. После реакций ПЦР полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют гель-электрофорезом. Затем фрагменты визуализируются с использованием меченого (радиоактивного или флуоресцентного) праймера или dNTP, как показано на рисунке 02.
Рисунок 02: Секвенирование по Сэнгеру
В чем разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера?
Различать статью в середине перед таблицей
Максам Гилберт против секвенирования Сэнгера |
|
| Секвенирование Maxam Gilbert - это первый метод, разработанный для секвенирования ДНК. | Метод секвенирования по Сэнгеру был введен после метода секвенирования Максама Гилберта. |
| Применение | |
| Этот метод используется редко. | Секвенирование по Сэнгеру обычно используется для секвенирования. |
| Использование опасных химических веществ | |
| В нем используются опасные химические вещества. | Использование опасных химикатов ограничено по сравнению с методом Максама Гилберта. |
| Маркировка для обнаружения | |
| В этом методе для мечения концов фрагментов ДНК используется радиоактивный P 32. | В секвенировании по Сэнгеру используются радиоактивно или флуоресцентно меченные ддНТФ. |
Резюме - Максам Гилберт vs Секвенирование Сэнгера
Секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера - это два типа методов секвенирования ДНК, относящиеся к секвенированию ДНК первого поколения. Секвенирование Maxam Gilbert - это первый метод, представленный для секвенирования ДНК в 1976 году, и он выполняется путем разрыва меченных на концах фрагментов ДНК химическими веществами, специфичными для конкретных оснований. Следовательно, это известно как химическое секвенирование. Метод секвенирования по Сэнгеру был представлен в 1977 году и основан на реакциях обрыва цепи, управляемых ддНТФ. Метод секвенирования по Сэнгеру популярен, чем метод Максама Гилберта из-за ряда недостатков метода Максама Гилберта, таких как чрезмерное потребление времени, использование опасных химикатов и т. Д. В этом заключается разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера.
