Разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера

2024 Автор: Mildred Bawerman | [email protected]. Последнее изменение: 2023-12-16 08:42

Ключевое отличие - секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера

Нуклеотиды - это основные структурные единицы и строительные блоки ДНК. Молекула ДНК состоит из полинуклеотидной цепи. В ДНК обнаружены четыре разных нуклеотида. Эти нуклеотиды состоят из четырех различных азотистых оснований, названных A (аденин), G (гуанин), C (цитозин), T (тимин). Порядок нуклеотидов в молекуле ДНК имеет большое значение, поскольку он кодирует важную генетическую информацию для роста и развития организмов. Секвенирование ДНК относится к процессу определения точной нуклеотидной последовательности ДНК. Существуют разные методы секвенирования ДНК. Секвенирование Максама Гилберта и секвенирование ДНК Сэнгера - это два метода секвенирования ДНК, которые относятся к секвенированию первого поколения. Процедура секвенирования Maxam Gilbert определяет последовательность оснований путем химического расщепления меченных 5'-концом фрагментов ДНК, предпочтительно по каждому из четырех нуклеотидов, и гель-электрофореза. Процедура секвенирования по Сэнгеру определяет нуклеотидную последовательность путем синтеза одноцепочечной ДНК с использованием ДНК-полимеразы и дидезоксинуклеотидов и гель-электрофореза. Это ключевое различие между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Обзор и основные отличия

2. Что такое Максам Гилберт

3. Что такое секвенирование по Сэнгеру

4. Сравнение бок о бок - секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера

5. Резюме

Что такое секвенирование Максама Гилберта?

Секвенирование Максама Гилберта, также известное как метод химического секвенирования, - это метод, который был разработан для определения порядка нуклеотидов в ДНК. Этот метод был предложен Уолтером Гилбертом и Аланом Максамом в 1976 году и стал популярным, поскольку его можно выполнять непосредственно с очищенной ДНК. Метод Максама Гилберта принадлежит к первому поколению секвенирования ДНК, и это был первый метод секвенирования, широко используемый учеными.

Основной принцип этого метода заключается в ограничении концевых меченых фрагментов ДНК по определенным основаниям химическими веществами и условиями, специфичными для конкретных оснований, и разделением меченых фрагментов электрофорезом, как показано на рисунке 01. Фрагменты разделяются в соответствии с их размерами на гель. Поскольку фрагменты помечены, последовательность молекулы ДНК может быть легко выведена.

Метод Максама Гилберта использует химические вещества для разрыва ДНК по определенным основаниям. Два распространенных химиката, называемые диметилсульфатом и гидразином, используются для избирательной атаки пуринов и пиримидинов соответственно.

Метод секвенирования Maxam Gilbert выполняется в несколько этапов, как показано ниже.

1. Очистка последовательности ДНК с использованием эндонуклеаз рестрикции
2. Мечение концов фрагментов ДНК путем добавления радиоактивных фосфатов
3. Очистка меченых фрагментов от немеченых фрагментов гель-электрофорезом
4. Разделение ДНК с концевой меткой на четыре пробирки и отдельная обработка химическими веществами, специфичными для оснований.
5. Электрофорез содержимого каждой пробирки на отдельных линиях на геле и разделение фрагментов по их длине.
6. Обнаружение отломков с помощью авторадиографа.

Рисунок 01: Секвенирование Максама Гилберта

Что такое секвенирование по Сэнгеру?

Секвенирование по Сэнгеру - это метод секвенирования, разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году для определения базовой последовательности данного фрагмента ДНК. Он также известен как метод секвенирования обрыва цепи или метод дидезокси-секвенирования. Этот метод работает по принципу избирательного включения дидезоксинуклеотидов, завершающих цепь (ddNTP), таких как ddGTP, ddCTP, ddATP и ddTTP, с помощью ДНК-полимеразы во время синтеза однонитевой ДНК для прекращения образования цепи. В дидезоксинуклеотидах отсутствуют 3 'ОН-группы для образования фосфодиэфирных связей с соседним нуклеотидом. Следовательно, образование цепи прекращается, как только ddNTP включается во вновь формирующуюся цепь во время секвенирования по Сэнгеру.

В этом методе четыре отдельных реакции синтеза ДНК (ПЦР) проводятся в четырех отдельных пробирках с одним типом ddNTP. К пробиркам для ПЦР также предъявляются другие требования, включая праймеры, dNTP, Taq-полимеразу, особые условия и т. Д. Четыре отдельных реакции проводят в четырех пробирках с четырьмя смесями. После реакций ПЦР полученные фрагменты ДНК денатурируют нагреванием и разделяют гель-электрофорезом. Затем фрагменты визуализируются с использованием меченого (радиоактивного или флуоресцентного) праймера или dNTP, как показано на рисунке 02.

Рисунок 02: Секвенирование по Сэнгеру

В чем разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера?

Различать статью в середине перед таблицей

Максам Гилберт против секвенирования Сэнгера
Секвенирование Maxam Gilbert - это первый метод, разработанный для секвенирования ДНК.	Метод секвенирования по Сэнгеру был введен после метода секвенирования Максама Гилберта.
Применение
Этот метод используется редко.	Секвенирование по Сэнгеру обычно используется для секвенирования.
Использование опасных химических веществ
В нем используются опасные химические вещества.	Использование опасных химикатов ограничено по сравнению с методом Максама Гилберта.
Маркировка для обнаружения
В этом методе для мечения концов фрагментов ДНК используется радиоактивный P 32.	В секвенировании по Сэнгеру используются радиоактивно или флуоресцентно меченные ддНТФ.

Резюме - Максам Гилберт vs Секвенирование Сэнгера

Секвенирование Максама Гилберта и Сэнгера - это два типа методов секвенирования ДНК, относящиеся к секвенированию ДНК первого поколения. Секвенирование Maxam Gilbert - это первый метод, представленный для секвенирования ДНК в 1976 году, и он выполняется путем разрыва меченных на концах фрагментов ДНК химическими веществами, специфичными для конкретных оснований. Следовательно, это известно как химическое секвенирование. Метод секвенирования по Сэнгеру был представлен в 1977 году и основан на реакциях обрыва цепи, управляемых ддНТФ. Метод секвенирования по Сэнгеру популярен, чем метод Максама Гилберта из-за ряда недостатков метода Максама Гилберта, таких как чрезмерное потребление времени, использование опасных химикатов и т. Д. В этом заключается разница между секвенированием Максама Гилберта и Сэнгера.